1949年4月23日上午，代总统李宗仁乘飞机离开南京，飞往桂林。三天前，国共双方在北平的和谈破裂，4月21日，人民解放军在长江中下游发起渡江战役。23日深夜，解放军第三野战军的部队进入南京城，24日，红旗在总统府门楼上升起。从1927年定都算起，南京作为国民政府首都前后二十二年，其间有八年半沦于日军之手。
沦陷之初
1937年12月13日南京陷落以后，日军在城内外屠杀、强奸、纵火，持续了数周。西方侨民组织了南京安全区国际委员会，由德国商人约翰·拉贝（John Rabe）任主席，在城西划出一片安全区收容难民；金陵女子文理学院的美国教师魏特琳（Minnie Vautrin）等人在校园里庇护了大批妇女和儿童。他们留下的日记、报告和影像，后来成了记录这场暴行的重要证据。
1938年3月，日本扶植的「中华民国维新政府」在南京成立，梁鸿志任行政院长，管辖范围限于日军占领的江苏、浙江、安徽部分地区。维新政府几乎没有独立的财源和军队，各项事务都由日本「顾问」控制。
汪精卫政权
1938年12月，汪精卫离开重庆，经昆明出走河内。1940年3月30日，他在南京成立「国民政府」，自称「还都」，沿用国民政府的名义和青天白日满地红旗，只在旗上加了一面写有「和平反共建国」字样的黄色三角布条。维新政府随之并入。汪政权的主要官员有陈公博、周佛海、梁鸿志等人，机关大多设在原国民政府的旧址。
汪政权名义上管辖华中、华东的日占区，实权始终在日本手里。1941年起，汪政权在苏南等地推行「清乡」，1943年1月对英美宣战，同年从日本手中「收回」上海等地的租界。1944年11月，汪精卫在日本名古屋病逝，灵柩运回南京，葬在中山陵附近的梅花山。
南京沦陷期间，重庆方面的情报人员一直在城里活动。1939年6月，日本驻南京总领事馆举行宴会，在馆内做杂役的詹长麟、詹长炳兄弟受军统指派，在酒中投毒，毒死两名日本官员，另有多人中毒，兄弟二人事后脱身。抗战期间军统在南京的行动中，这一次影响较大。
受降与还都
1945年8月日本投降。9月9日，中国战区受降仪式在南京原中央陆军军官学校的大礼堂举行，中国陆军总司令何应钦接受日本中国派遣军总司令冈村宁次递交的投降书。随后的接收很快招致普遍不满。各路接收人员争夺敌伪房产、物资和企业，时人用「五子登科」讥讽他们，五子指金子、房子、车子、票子和女子。沦陷区流传的一句顺口溜是：「想中央，盼中央，中央来了更遭殃。」
1946年1月，国民政府派工兵炸毁梅花山的汪精卫墓，焚化棺木。同年5月5日，国民政府正式还都南京。战后南京设立审判战犯军事法庭，1947年审判了南京大屠杀的主要责任者之一、日军第六师团师团长谷寿夫，判处死刑，4月在雨花台执行。
最后三年
还都以后，南京成了国共谈判的场所之一。1946年5月，中共代表团从重庆迁到南京，驻在梅园新村，周恩来、董必武率团与国民政府谈判，美国特使马歇尔（George C. Marshall）居间调停。调停没有成功，1947年3月，中共代表团撤回延安。
战后的民众运动也以南京为中心。1946年6月23日，上海各界推举马叙伦等人组成和平请愿团，到南京请愿，要求停止内战，代表团在下关车站遭暴徒围殴，多人受伤，史称「下关事件」。1947年5月20日，南京、上海、苏州、杭州等地的大学生在南京举行「反饥饿、反内战」游行，队伍走到珠江路一带时遭军警阻拦殴打，多名学生受伤被捕，即「五二〇运动」。
1946年11月，制宪国民大会在南京国民大会堂召开，通过《中华民国宪法》。1948年3月至5月，第一届国民大会在这里举行，选举蒋介石为总统、李宗仁为副总统，国民政府改称总统府。这时东北和华北的战局已经对国民政府十分不利，城里物价飞涨，金圆券发行以后，限价和抢购在南京街头都出现过。
1949年1月，蒋介石宣布引退，李宗仁代行总统职权，派代表团到北平谈判。4月20日，国民政府拒绝在《国内和平协定》上签字，谈判破裂。此后几天里，机关人员、眷属和物资经下关码头与明故宫机场撤离，南京城在4月23日夜里易手。